在生物实验中，磷酸缓冲液是一种非常常见的缓冲体系，广泛应用于细胞培养、酶反应、蛋白质纯化等实验过程中。其中，pH 7.5、浓度为50 mM的磷酸缓冲液因其接近生理条件，常被用于多种生化和分子生物学实验。本文将详细介绍如何正确配制这种缓冲液。
一、材料准备
在开始配制之前，需要准备好以下试剂与设备：
- 磷酸二氢钠（NaH₂PO₄·H₂O）
- 磷酸氢二钠（Na₂HPO₄·12H₂O）
- 蒸馏水或去离子水
- pH计或pH试纸
- 磁力搅拌器或磁子
- 容量瓶（如1 L或500 mL）
- 移液管或量筒
- 溶液储存瓶
二、计算所需试剂用量
为了配制50 mM的磷酸缓冲液，pH值为7.5，需根据Henderson-Hasselbalch方程进行计算。该缓冲体系由弱酸（NaH₂PO₄）和其共轭碱（Na₂HPO₄）组成。
公式如下：
$$
\text{pH} = \text{p}K_a + \log\left(\frac{[\text{A}^-]}{[\text{HA}]}\right)
$$
对于磷酸盐体系，pKa约为6.86（对应H₂PO₄⁻/HPO₄²⁻）。带入pH=7.5：
$$
7.5 = 6.86 + \log\left(\frac{[HPO_4^{2-}]}{[H_2PO_4^-]}\right)
$$
解得：
$$
\log\left(\frac{[HPO_4^{2-}]}{[H_2PO_4^-]}\right) = 0.64 \Rightarrow \frac{[HPO_4^{2-}]}{[H_2PO_4^-]} = 4.37
$$
因此，可按此比例混合两种盐，总浓度为50 mM。
假设总体积为1 L，则：
- NaH₂PO₄：约10.9 mmol
- Na₂HPO₄：约47.8 mmol
换算成质量（以分子量计算）：
- NaH₂PO₄·H₂O 分子量为137.99 g/mol → 约1.50 g
- Na₂HPO₄·12H₂O 分子量为358.14 g/mol → 约17.13 g
三、配制步骤
1. 称量试剂：按照上述计算结果，准确称取所需量的NaH₂PO₄和Na₂HPO₄。
2. 溶解：将两种盐加入适量蒸馏水中，轻轻搅拌至完全溶解。
3. 定容：将溶液转移至容量瓶中，并加水至目标体积（如1 L）。
4. 调节pH：使用pH计测量当前pH值，若偏离7.5，可用稀释的HCl或NaOH进行微调。
5. 混匀：充分摇匀后，静置一段时间，确保pH稳定。
6. 保存：将缓冲液分装至干净的玻璃瓶中，密封并贴上标签，置于4℃冰箱中保存。
四、注意事项
- 实验前应确保所有器具清洁无污染。
- 配制过程中应避免剧烈震荡，以免引入气泡影响pH测量。
- 若需长期保存，建议过滤除菌或加入少量防腐剂（如NaN₃）。
- 不同实验室可能因仪器精度不同，需根据实际pH值微调比例。
五、结语
磷酸缓冲液（pH 7.5，50 mM）是许多生命科学研究中不可或缺的基础试剂。通过合理计算和规范操作，可以高效、准确地完成其配制，为后续实验提供稳定的环境支持。掌握这一基础技能，对科研人员来说具有重要意义。
